크리오전자현미경

크리오전자현미경 분석의 첫 번째이자 가장 중요한 단계는 시료를 가능한 한 자연 상태에 가까운 형태로 준비하는 것이다. 이를 위해 시료는 액체 상태의 에탄을 이용해 극저온으로 급속 냉동된다. 이 과정을 빙결이라고 한다. 시료 용액을 얇은 탄소 필름이 코팅된 특수 그리드에 도포한 후, 액체 에탄(약 -180°C)에 담가 순식간에 얼린다. 이렇게 하면 물 분자가 결정을 형성할 시간 없이 비정질의 유리 상태로 고정되어, 시료 주변에 얇은 비정질 얼음층이 형성된다. 이 얼음층은 시료를 보호하면서도 전자선이 투과할 수 있게 해준다.

빙결의 핵심 목표는 시료의 구조를 생체 내에 존재하는 용액 상태와 유사하게 보존하는 것이다. 전통적인 전자현미경 시료 준비법인 음염법이나 고정/탈수 과정은 화학적 처리가 가해져 구조 변형이 일어날 수 있다. 반면, 급속 냉동은 이러한 인공적 변형을 최소화하여 단백질 복합체나 바이러스와 같은 생체 분자가 기능을 수행하는 모습 그대로의 구조를 포착할 수 있게 한다. 성공적인 빙결을 위해서는 얼음층의 두께와 균일성이 매우 중요하며, 이를 위해 다양한 자동화 장비가 개발되어 사용되고 있다.

시료가 준비되면, 이를 투과전자현미경의 시료 홀더에 장착하여 촬영을 진행한다. 촬영은 극저온 환경, 일반적으로 액체 질소 온도(약 -196°C)에서 이루어지며, 이는 시료의 빙결 상태를 유지하고 전자선에 의한 방사선 손상을 최소화하기 위함이다. 전자선이 얇은 빙결층을 통과하면서 생체 분자에 의해 산란되어 생성되는 2차원 투영 이미지가 검출기에 기록된다. 이때, 시료는 다양한 각도로 기울여지며 수만 장에서 수백만 장에 이르는 방대한 2차원 이미지 데이터가 획득된다.

촬영 과정에서의 핵심 과제는 시료에 가해지는 전자선의 총량을 최소화하는 것이다. 과도한 전자선 노출은 시료를 손상시켜 고해상도 정보를 파괴하기 때문이다. 이를 위해 저용량 촬영 기술이 사용되며, 현대의 직접 전자 검출 카메라는 매우 낮은 신호에서도 높은 대비의 이미지를 기록할 수 있다. 또한, 자동화된 데이터 수집 소프트웨어를 통해 효율적으로 대량의 이미지를 연속적으로 촬영한다.

획득된 2차원 투영 이미지들은 후속 이미지 처리 단계의 원재료가 된다. 각 이미지는 시료 내 동일한 분자 복합체가 서로 다른 방향으로 얼어붙어 생성한 다양한 각도의 모습을 담고 있으며, 이는 3차원 구조를 재구성하는 데 필수적이다. 촬영 단계에서의 높은 데이터 품질과 양은 최종 구조의 해상도와 신뢰도를 직접적으로 결정한다.

촬영된 수천~수백만 장의 2차원 투영 이미지는 복잡한 컴퓨터 이미지 처리 과정을 거쳐 최종 3차원 구조로 재구성된다. 이 과정은 크게 입자 픽킹, 분류 및 정렬, 3차원 재구성의 단계로 나뉜다. 먼저, 자동화 알고리즘을 사용하여 미세한 노이즈 속에서 개별 생체 분자 입자(예: 단백질 복합체)를 감지하고 추출하는 입자 픽킹이 수행된다. 추출된 수많은 입자 이미지들은 서로 다른 방향으로 얼어붙은 동일한 분자의 모습을 담고 있으며, 이들은 2차원 분류를 통해 유사한 투영 방향을 가진 그룹으로 묶인다.

분류된 입자 이미지들은 정교한 정렬 알고리즘을 통해 회전 및 이동 보정을 받은 후, 3차원 재구성 알고리즘의 입력값으로 사용된다. 가장 일반적으로 사용되는 재구성 방법은 단입자 분석이다. 이 방법은 서로 다른 각도에서 촬영된 2차원 투영 이미지들을 수학적으로 조합하여 원래의 3차원 구조를 복원한다. 재구성 과정은 초기 모델로부터 시작하여 반복적인 정렬과 평균화를 거쳐 점차 해상도를 개선해 나가는 방식으로 진행된다.

재구성된 3차원 구조는 전자밀도 지도 형태로 출력되며, 이 지도를 바탕으로 연구자는 단백질 나선 구조나 핵산 사슬과 같은 분자의 정확한 형태를 해석하고 원자 모델을 구축할 수 있다. 고해상도 구조를 얻기 위해서는 충분한 수의 입자 이미지와 정밀한 이미지 처리, 그리고 강력한 컴퓨팅 자원이 필수적이다. 이 분야의 발전은 인공지능과 딥러닝 기술을 접목한 새로운 이미지 처리 알고리즘의 등장으로 더욱 가속화되고 있다.

빙결 장치는 크리오전자현미경 분석의 첫 번째이자 가장 중요한 단계인 시료의 급속 냉동을 담당하는 핵심 장비이다. 이 과정은 시료를 가능한 한 자연 상태에 가까운 형태로 보존하여 고해상도 구조 분석의 기초를 마련한다.

빙결 장치는 일반적으로 액체 에탄을 사용하여 시료를 순간적으로 냉각한다. 시료가 담긴 격자망을 액체 에탄에 담그면 주변의 물이 비정질 얼음으로 변하며, 이는 시료 내 생체 분자를 갑작스러운 결정화로부터 보호한다. 이렇게 형성된 얇은 비정질 얼음 층 안에 분자가 포획되어, 투과전자현미경으로 관찰하기에 적합한 상태가 된다. 이 과정의 성공 여부는 최종 구조의 해상도를 크게 좌우한다.

빙결 장치의 구성은 주로 온도 조절 시스템, 습도 제어 챔버, 정밀한 로봇 암으로 이루어진다. 로봇 암은 시료 격자망을 정확하게 액체 에탄 용기에 담그는 역할을 하며, 이 모든 과정은 컴퓨터로 제어되어 재현성을 높인다. 최신 장비는 자동화되어 있어 사용자가 설정한 파라미터에 따라 일관된 품질의 시료를 대량으로 준비할 수 있다.

크리오전자현미경의 핵심 이미징 장비는 투과전자현미경이다. 이 장비는 고전압에서 가속된 전자선을 시료에 투과시켜 그 상호작용을 통해 이미지를 형성한다. 크리오전자현미경에서는 특히 시료가 빙결된 상태를 유지할 수 있도록 장비에 특수한 냉각 홀더가 장착되며, 이 홀더는 액체 질소나 액체 헬륨을 이용해 시료를 극저온(대략 -180°C 이하)으로 유지한다. 이는 전자선에 의한 방사선 손상을 최소화하고 시료의 자연스러운 구조를 보존하는 데 필수적이다.

투과전자현미경의 성능은 고전압 가속 전원, 고품질의 자기 렌즈, 그리고 민감한 검출기 시스템에 크게 의존한다. 현대의 크리오전자현미경은 주로 200-300 kV 급의 전자총을 사용하며, 이를 통해 얇은 빙결 시료를 효과적으로 투과시킬 수 있다. 또한, 위상 콘트라스트를 극대화하기 위해 결함이 적은 자기 렌즈와 위상판이 종종 활용된다. 이러한 정밀한 광학 시스템은 생체 분자의 미세한 구조적 세부 사항을 포착하는 데 결정적인 역할을 한다.

크리오전자현미경의 검출기는 전자선이 시료를 통과한 후 생성되는 약한 신호를 감지하고 디지털 이미지로 변환하는 핵심 부품이다. 초기에는 사진 필름이 사용되었으나, 현재는 대부분 직접 전자 검출 카메라가 표준으로 자리 잡았다. 이 카메라는 전자가 직접 반도체 센서에 충돌하여 전기 신호로 변환하는 방식으로 작동하며, 기존의 간접 검출 방식에 비해 훨씬 높은 감도와 신호 대 잡음비를 제공한다.

검출기의 성능은 획득한 2차원 투영 이미지의 질을 결정하며, 이는 최종 3차원 재구성 해상도에 직접적인 영향을 미친다. 주요 성능 지표로는 감도, 프레임 속도, 동적 범위, 그리고 가장 중요한 공간 분해능이 있다. 특히 고해상도 정보는 매우 약한 신호로 존재하기 때문에, 검출기의 높은 감도와 낮은 잡음은 원자 수준의 구조를 해석하는 데 필수적이다.

최신 직접 전자 검출 카메라는 초고속으로 연속 촬영이 가능하여, 마이크로초 단위의 빠른 생체 분자 운동을 포착하거나 전자선에 의한 시료 손상을 보정하는 데 활용된다. 이처럼 검출기 기술의 발전은 크리오전자현미경이 구조생물학의 핵심 도구로 도약하는 데 크게 기여했다.

크리오전자현미경의 데이터 처리 시스템은 획득한 수많은 2차원 투영 이미지로부터 최종 3차원 구조 모델을 생성하는 핵심 단계를 담당한다. 이 과정은 대규모의 계산 작업을 수반하며, 주로 단입자 분석 또는 전자단층촬영 기법에 따라 처리 흐름이 세분화된다.

일반적인 데이터 처리 파이프라인은 크리오전자현미경 이미지의 낮은 신호대잡음비를 극복하고 입자의 방향을 정렬하는 데 중점을 둔다. 주요 단계는 다음과 같은 표로 요약할 수 있다.

이러한 복잡한 계산은 고성능 컴퓨팅 클러스터 또는 그래픽 처리 장치 기반의 병렬 처리 시스템에서 수행된다. 또한, 인공지능 기반의 알고리즘, 특히 딥러닝 기술이 입자 픽킹, 2차원 분류, 모델 정제 등 여러 단계에서 정확도와 처리 속도를 획기적으로 향상시키는 데 기여하고 있다. 최종적으로 생성된 3차원 전자 밀도지도는 생체 분자의 원자 수준 구조 모델 구축을 위한 기초가 된다.

크리오전자현미경의 가장 큰 장점은 결정화가 어려운 대형 생체 분자 복합체의 구조를 분석할 수 있다는 점이다. X선 결정학은 고품질의 단일 결정을 필요로 하지만, 크리오전자현미경은 극저온으로 급속 냉동된 용액 상태의 시료를 사용한다. 이로 인해 리보솜, 바이러스 캡시드, 막 단백질 복합체와 같이 크고 유연하며 안정적인 결정을 형성하기 어려운 표적의 구조 연구에 혁명을 가져왔다.

또한 이 기술은 시료를 용액 상태에 가까운 환경에서 관찰할 수 있어 생체 내에서의 자연스러운 구조를 보존한다는 장점이 있다. 화학적 고정이나 염색 과정이 필요 없어 인공적 변형을 최소화하며, 다양한 기능적 상태(예: 결합 상태, 활성화 상태)의 분자를 포착하여 역동적인 구조 변화를 연구하는 데 유용하다.

해상도 측면에서도 비약적인 발전을 이루어, 현재는 원자 수준(~1.2 Å)의 고해상도 구조 결정이 가능해졌다. 이는 개별 원자의 위치를 식별할 수 있는 수준으로, 효소의 활성 부위나 약물 결합 부위를 정밀하게 규명하는 데 필수적이다. 이러한 고해상도 정보는 구조생물학과 신약 개발에 직접적으로 기여하고 있다.

크리오전자현미경은 뛰어난 장점에도 불구하고 몇 가지 명확한 단점과 기술적 한계를 지니고 있다. 가장 큰 과제는 여전히 높은 장비 비용과 운영의 복잡성이다. 고성능 투과전자현미경, 초고속 냉각 장치, 민감한 전자 검출기, 그리고 대규모 데이터 처리를 위한 고성능 컴퓨팅 인프라가 모두 필요하여 초기 투자 및 유지 비용이 매우 크다. 이는 연구 기관의 접근성을 제한하는 요인으로 작용한다.

또한, 이 기술은 시료 두께에 민감한 한계를 보인다. 전자선이 시료를 완전히 투과할 수 있어야 명확한 이미지를 얻을 수 있기 때문에, 일반적으로 300 나노미터 이하의 비교적 얇은 시료에 가장 적합하다. 이로 인해 두꺼운 세포나 조직 전체를 그대로 분석하는 데는 어려움이 따르며, 이를 해결하기 위해서는 세포를 얇게 절단하는 크리오 전자 단층 촬영과 같은 추가적인 기술이 필요하다.

데이터 획득 및 처리 과정 또한 시간이 많이 소요되고 복잡하다는 점이 단점이다. 하나의 고해상도 구조를 얻기 위해서는 수만에서 수십만 장에 이르는 2차원 투영 이미지를 획득해야 하며, 이 방대한 데이터 세트로부터 3차원 구조를 재구성하는 과정에는 정교한 이미지 처리 알고리즘과 상당한 계산 자원이 필요하다. 따라서 숙련된 전문가의 운영과 분석이 필수적이며, 전체 워크플로우가 빠르지 않다.

마지막으로, 크리오전자현미경으로 얻은 구조는 여전히 정적인 스냅샷에 가깝다는 본질적 한계가 있다. 생체 내에서 분자가 어떻게 움직이고 기능하는지에 대한 역동적인 정보, 즉 구조의 변화와 시간에 따른 상호작용을 직접 포착하기는 어렵다. 이러한 기능적 역학을 이해하기 위해서는 분자 동역학 시뮬레이션이나 다른 생화학적 실험 기법과의 연계 연구가 보완적으로 요구된다.

크리오전자현미경은 구조생물학 분야에 혁명을 가져온 핵심 기술이다. 이 기술은 생체 분자의 3차원 구조를 원자 수준의 해상도로 규명하는 것을 목표로 하는 구조생물학의 근본적인 과제를 해결하는 데 크게 기여한다. 특히 단백질 복합체, 바이러스, 리보솜 및 세포막 단백질과 같이 크기가 크거나 결정화가 어려운 생체 거대분자의 구조를 연구하는 데 필수적인 도구로 자리 잡았다.

기존의 X선 결정학은 고품질의 결정을 필요로 하기 때문에 많은 생체 분자에 적용하기 어려웠으나, 크리오전자현미경은 용액 상태에 가까운 환경에서 시료를 급속 냉동하여 관찰할 수 있다. 이는 분자가 기능을 수행하는 자연스러운 구조에 더 가깝게 보존된다는 점에서 큰 장점이다. 이를 통해 연구자들은 단백질이 다른 분자와 어떻게 상호작용하는지, 또는 약물이 표적 단백질에 어떻게 결합하는지에 대한 정확한 구조적 정보를 얻을 수 있다.

이 기술의 발전은 구조생물학의 연구 범위를 크게 확장시켰다. 과거에는 구조 규명이 거의 불가능했던 대형 단백질 복합체나 세포 소기관의 정밀한 구조가 속속들이 보고되고 있으며, 이는 생명 현상의 분자적 메커니즘을 이해하는 데 중요한 토대를 제공한다. 따라서 크리오전자현미경은 현대 구조생물학 연구의 표준 방법론으로 확고히 자리매김하였다.

크리오전자현미경은 바이러스학 분야에서 구조 연구를 혁신적으로 변화시킨 핵심 도구이다. 이 기술은 바이러스 입자 전체나 바이러스 표면의 중요한 항원 단백질 복합체와 같은 대형 구조물의 고해상도 3차원 구조를 용액 상태에 가까운 자연스러운 형태로 규명할 수 있게 해준다. 특히 인플루엔자 바이러스, 에이즈를 일으키는 HIV, 코로나바이러스와 같은 외피를 가진 바이러스의 표면 스파이크 단백질 구조를 정밀하게 분석하는 데 크게 기여했다.

이러한 구조 정보는 바이러스가 숙주 세포에 침투하는 메커니즘, 항체에 의한 중화 반응, 약물 저항성 발생 원리 등을 분자 수준에서 이해하는 데 필수적이다. 예를 들어, SARS-CoV-2의 스파이크 단백질 구조가 크리오전자현미경으로 신속하게 규명되면서, 백신 설계와 치료제 개발이 가속화될 수 있었다. 또한, 바이러스의 생활사 중 다양한 중간체 상태를 포착하여 그 역동적인 구조 변화 과정을 연구하는 데도 활용된다.

크리오전자현미경의 강점은 바이러스 입자 자체를 정제한 후 별도의 결정화 과정 없이도 분석할 수 있다는 점이다. 이는 크고 복잡하며 불안정한 바이러스 입자를 연구하는 데 매우 유리하며, X선 결정학이나 핵자기 공명 분광법으로는 접근하기 어려웠던 많은 바이러스 구조 연구의 문을 열었다. 결과적으로 바이러스학은 이 기술을 통해 미시적 구조와 거시적 생물학적 기능을 직접 연결하는 새로운 지평에 도달하게 되었다.

크리오전자현미경은 세포 생물학 연구에서 세포 내부의 복잡한 구조와 그 기능을 원자 수준에 가까운 해상도로 직접 관찰할 수 있게 해주는 혁신적인 도구이다. 이 기술은 세포를 구성하는 다양한 세포 소기관이나 대형 단백질 복합체를 그 기능을 수행하는 자연 상태 그대로, 즉 용액 상태에 가까운 형태로 고정하여 분석할 수 있다. 이는 기존의 X선 결정학이 필요로 하는 결정화 과정을 거치지 않아도 되므로, 세포막 단백질이나 거대한 리보솜과 같이 결정화가 매우 어려운 생체 분자들의 구조를 규명하는 데 결정적인 역할을 하고 있다.

특히, 크리오전자현미경을 활용한 세포 단층촬영 기술은 전체 세포나 세포 절편을 3차원으로 재구성하여 내부 구조를 가시화한다. 이를 통해 연구자들은 미토콘드리아의 내막 구조, 소포체의 네트워크, 골지체의 층상 구조, 그리고 세포골격의 미세한 배열 등을 생생하게 관찰할 수 있다. 이는 단순한 정적 구조를 넘어, 세포가 분열하거나 세포 사멸을 진행할 때, 또는 바이러스가 감염할 때 일어나는 역동적인 구조 변화를 포착하는 데에도 활용된다.

이러한 연구는 단백질의 구조와 기능을 연결짓는 구조생물학의 핵심 목표를 실현하며, 세포라는 기본 생명 단위가 어떻게 작동하는지에 대한 이해를 근본적으로 확장하고 있다. 결과적으로, 다양한 세포 병리학적 상태나 유전 질환의 근본 원인을 구조적 차원에서 규명하고, 표적 치료법 개발에 중요한 기초 정보를 제공한다.

크리오전자현미경은 신약 개발 과정에서 표적 단백질의 정밀한 3차원 구조를 규명하는 핵심 도구로 자리 잡았다. 특히 약물이 결합하는 표적 부위의 구조를 원자 수준에서 보여줌으로써, 합리적 약물 설계의 기반을 제공한다. 이 기술은 단백질이나 바이러스와 같은 대형 생체 분자 복합체를 용액 상태에 가까운 형태로 분석할 수 있어, 약물 후보 물질이 실제 생체 내에서 어떻게 표적과 상호작용하는지에 대한 중요한 정보를 얻을 수 있다.

신약 개발 파이프라인에서 크리오전자현미경의 활용은 주로 표적 발굴 및 검증 단계, 그리고 선도 물질 최적화 단계에서 두드러진다. 연구자들은 이 기술을 통해 약물 후보 물질이 표적 단백질의 특정 포켓에 결합하는 정확한 모습을 시각화하고, 결합 강도와 특이성을 결정짓는 원자 간 상호작용을 직접 관찰할 수 있다. 이를 바탕으로 보다 효능이 높고 부작용이 적은 화합물을 설계하는 것이 가능해진다.

전통적인 X선 결정학으로는 결정화가 어려운 막단백질이나 큰 복합체가 많은 질병 표적이기 때문에, 크리오전자현미경의 역할은 더욱 중요해지고 있다. 이 기술은 항체 약물이나 바이러스 백신 개발과 같은 생물의약품 분야에서도 표면 항원의 정밀한 구조를 밝혀 효과적인 치료제 설계에 기여하고 있다. 결과적으로, 크리오전자현미경은 더 빠르고 정확한 신약 개발을 가능하게 하는 강력한 구조생물학 도구이다.

단입자 분석은 크리오전자현미경을 이용한 구조 결정 방법론 중 하나로, 동일한 생체 분자 복합체의 수많은 무작위 방향으로 얼어붙은 입자 이미지를 수집하고 분류하여 평균화함으로써 고해상도 3차원 구조를 재구성하는 기법이다. 이 방법은 단백질이나 바이러스와 같은 개별 생체 분자가 결정을 형성하지 않아도, 즉 비결정성 시료라도 분석이 가능하다는 점이 핵심 특징이다.

이 기법의 과정은 크게 이미지 수집, 입자 피킹, 2차원 분류, 3차원 재구성으로 나뉜다. 먼저 투과전자현미경으로 수만에서 수백만 개에 이르는 개별 분자의 2차원 투영 이미지를 획득한다. 이후 컴퓨터 알고리즘을 통해 배경으로부터 각 입자의 위치를 찾아내고, 유사한 방향을 가진 입자 이미지들을 분류 및 정렬하여 평균화한다. 마지막으로 다양한 방향에서 얻은 평균화된 2차원 투영으로부터 3차원 구조를 계산적으로 재구성한다.

단입자 분석의 성능은 입자 이미지의 수와 질에 크게 의존한다. 고해상도 구조를 얻기 위해서는 수십만 개 이상의 입자 이미지가 필요하며, 이 과정에는 강력한 데이터 처리 시스템과 정교한 재구성 알고리즘이 필수적이다. 이 방법은 특히 대형이고 유연한 구조를 가진 리보솜, 막 단백질 복합체, 바이러스 캡시드 등의 구조 생물학 연구에 혁명적인 기여를 했다.

단입자 분석은 전자단층촬영과 함께 현대 크리오전자현미경의 두 주요 방법론을 이루며, X선 결정학이나 핵자기 공명 분광법으로 분석하기 어려운 거대 분자 복합체의 구조를 규명하는 데 핵심 역할을 한다.

전자단층촬영은 투과전자현미경을 이용하여 시료를 다양한 각도에서 촬영한 뒤, 획득한 2차원 투영 이미지들을 컴퓨터 알고리즘으로 재구성하여 3차원 구조를 얻는 기술이다. 이 방법은 특히 생물학적 시료의 내부 구조를 고해상도로 가시화하는 데 유용하다. 크리오전자현미경과 결합된 전자단층촬영은 시료를 빙결 상태로 유지한 채로 다양한 각도에서 데이터를 수집하여, 세포 소기관이나 대형 분자 복합체와 같은 두꺼운 시료의 3차원 구조를 결정하는 데 핵심적인 역할을 한다.

전자단층촬영의 일반적인 과정은 다음과 같다. 먼저, 시료를 시야 안에 고정하고 투과전자현미경의 샘플 홀더를 회전시켜 정해진 각도 간격(예: 1~2도)으로 일련의 2차원 이미지를 연속적으로 촬영한다. 이후 수집된 이미지 세트는 필터링된 역투영법이나 반복적 재구성 알고리즘과 같은 계산 방법을 통해 처리된다. 이 과정을 통해 시료의 내부 구조에 대한 3차원 볼륨 데이터가 생성된다.

크리오전자현미경 기반 전자단층촬영은 생물학 분야에서 널리 응용되고 있다. 이 기술은 세포 내에서 단백질 복합체나 바이러스 입자가 어떻게 배열되어 있는지, 또는 세포 소기관의 내부 구조가 어떠한지를 연구하는 데 필수적이다. 예를 들어, 리보솜이나 세포 골격 네트워크의 구조를 결정하는 데 성공적으로 활용되어 왔다.

전자단층촬영의 주요 장점은 시료를 절단하거나 염색하지 않고도 원래 상태에 가까운 3차원 구조 정보를 제공할 수 있다는 점이다. 그러나 기술적 한계도 존재하는데, 전자선에 의한 시료 손상과 다중 산란 효과로 인해 시료의 두께에 제한이 있으며, 데이터 수집과 처리에 상당한 시간과 계산 자원이 필요하다는 점을 들 수 있다.

X선 결정학은 원자 수준의 고해상도 구조 정보를 제공하는 강력한 구조 결정 방법이다. 이 방법은 분석 대상 분자를 규칙적인 3차원 격자 배열, 즉 결정으로 성장시켜야 한다. 결정에 X선을 조사하면 회절 패턴이 생성되고, 이 패턴을 수학적으로 분석하여 전자 밀도 지도를 계산함으로써 분자의 정확한 3차원 구조를 얻을 수 있다.

X선 결정학은 장기간 구조 생물학의 표준 방법으로 자리 잡아왔으며, 수많은 단백질과 작은 분자의 정밀한 구조를 밝혀냈다. 그러나 이 방법의 가장 큰 한계는 분석을 위해 고품질의 결정을 얻어야 한다는 점이다. 특히 막 단백질이나 거대한 단백질 복합체와 같이 크고 유연한 생체 분자들은 결정화가 매우 어렵거나 불가능한 경우가 많다.

이러한 한계는 크리오전자현미경의 발전을 촉진하는 중요한 동인이 되었다. 크리오전자현미경은 결정화가 필요 없이 용액 상태에 가까운 환경에서 분자의 구조를 분석할 수 있어, X선 결정학으로 접근하기 어려웠던 많은 대상들의 구조 규명을 가능하게 했다. 오늘날 이 두 기술은 상호 보완적으로 활용되며, X선 결정학은 원자 수준의 초고해상도 구조를, 크리오전자현미경은 결정화 없이 거대 복합체의 구조를 규명하는 데 각각 강점을 보인다.

크리오전자현미경은 생체 분자의 고해상도 3차원 구조를 결정하는 강력한 도구로 자리 잡았으며, 이는 구조생물학 분야를 혁신적으로 변화시켰다. 이 기술은 X선 결정학이나 핵자기 공명 분광법과 같은 기존의 주요 구조 결정 방법과는 다른 접근법을 취한다. X선 결정학은 분석 대상 분자를 결정화해야 하는 반면, 크리오전자현미경은 용액 상태에 가까운 환경에서 분자를 관찰할 수 있다. 또한 핵자기 공명 분광법이 주로 작은 단백질의 구조와 역동성을 연구하는 데 강점을 보이는 것과 달리, 크리오전자현미경은 바이러스나 리보솜과 같은 매우 큰 생체 분자 복합체의 정적인 고해상도 구조를 밝히는 데 특히 유리하다.

이러한 방법론들 사이의 주요 차이점은 다음과 같이 표로 정리할 수 있다.

이처럼 각 기술은 서로 보완적인 관계에 있다. 예를 들어, 크리오전자현미경으로 얻은 대형 복합체의 전체 구조는 핵자기 공명 분광법을 통해 특정 부위의 상세한 결합 정보나 역동성을 보완하는 데 활용될 수 있다. 최근에는 이러한 다중 방법 접근법이 복잡한 생물학적 과정을 이해하는 표준이 되고 있다. 따라서 현대 구조생물학 연구는 문제의 성격에 따라 크리오전자현미경, X선 결정학, 핵자기 공명 분광법을 유기적으로 결합하여 가장 포괄적인 정보를 얻고자 한다.