유전자 가위(CRISPR-Cas9) 기술 (r1)

CRISPR 배열은 박테리아와 고세균의 게놈에 존재하는 특이한 DNA 서열의 반복 구조이다. 이 배열은 짧은 회문 서열이 규칙적으로 반복되며, 각 반복 사이에는 '스페이서(spacer)'라고 불리는 독특한 DNA 조각이 끼워져 있다. 이러한 스페이서는 과거에 박테리아를 감염시켰던 바이러스나 플라스미드의 DNA 조각에서 유래한다[1]. CRISPR 배열은 Cas 유전자 클러스터와 함께 위치하며, 이는 CRISPR-Cas 시스템의 두 가지 핵심 구성 요소를 형성한다.

Cas9 단백질은 II형 CRISPR-Cas 시스템에 속하는 RNA-유도 DNA 절단 효소이다. 이 단백질은 두 개의 핵심적인 뉴클레아제 도메인, 즉 HNH 도메인과 RuvC 도메인을 보유한다. HNH 도메인은 가이드 RNA와 상보적인 표적 DNA 가닥을 절단하는 반면, RuvC 도메인은 비상보적 가닥을 절단한다. 이중 절단을 통해 표적 부위에 이중 가닥 절단을 생성한다. Cas9 단백질은 그 자체로는 비활성 상태이며, 특정 RNA 분자와 복합체를 형성해야만 활성화된다.

CRISPR 배열은 전사되어 긴 전구체 RNA를 생성하며, 이는 추가로 처리되어 짧은 CRISPR RNA로 성숙한다. 각 crRNA는 하나의 스페이서 서열을 포함한다. 유전자 편집 도구로 사용될 때는, 이 crRNA와 Cas9 단백질을 표적 부위로 안내하는 또 다른 짧은 RNA인 트랜스-활성화 crRNA가 결합한 합성 가이드 RNA가 일반적으로 사용된다. gRNA의 스페이서 부위는 편집하고자 하는 표적 DNA 서열과 상보적으로 결합하도록 설계된다.

이 시스템에서 CRISPR 배열은 표적을 지정하는 '주소록' 역할을 하고, Cas9 단백질은 그 주소를 찾아가 절단을 수행하는 '분자 가위' 역할을 한다. 이 두 요소의 결합은 높은 특이성을 가진 프로그래밍 가능한 유전자 편집을 가능하게 하는 기초를 제공한다.

가이드 RNA(gRNA)는 CRISPR-Cas9 시스템이 특정 DNA 서열을 정확하게 찾아낼 수 있도록 안내하는 핵심 구성 요소이다. 이는 CRISPR RNA(crRNA)와 트랜스-활성화 crRNA(tracrRNA)가 결합한 단일 분자로, 인공적으로 설계되어 사용된다. gRNA의 5' 말단 약 20개의 염기로 이루어진 '스페이서 서열' 부분이 표적 DNA와 상보적으로 결합하여 표적 위치를 지정한다. 나머지 부분은 Cas9 단백질과 결합하는 스캐폴드 구조를 형성하여 복합체를 안정화시킨다.

gRNA의 설계는 편집의 정확도와 효율성을 결정하는 가장 중요한 단계 중 하나이다. 표적 DNA 서열과 완벽하게 상보적인 gRNA를 설계하면, Cas9-gRNA 복합체는 해당 서열을 포함하는 유전체 상의 위치로 이동하여 결합한다. 이때 표적 DNA 서열 바로 옆에 존재하는 짧은 특정 서열인 PAM 서열(Protospacer Adjacent Motif)이 Cas9 단백질에 의해 인식되어야만 절단이 일어난다. 이 PAM 인식은 원하지 않는 위치에서의 절단을 추가적으로 방지하는 안전 장치 역할을 한다.

따라서 연구자는 변경하고자 하는 유전자 위치의 서열을 분석하고, 그 근처에 적합한 PAM 서열이 존재하는지를 확인한 후, 그에 상응하는 gRNA를 합성한다. 이렇게 설계된 gRNA는 세포 내에서 Cas9 단백질과 복합체를 형성하고, 프로그램된 유전자 위치로 정확하게 안내하여 이중 가닥 절단을 유도한다. gRNA의 서열만 변경함으로써 하나의 Cas9 단백질로 다양한 DNA 위치를 대상으로 할 수 있어, 기술의 다양성과 접근성을 크게 높이는 원동력이 되었다.

Cas9 단백질은 가이드 RNA가 안내하는 표적 DNA 서열에 도달하면, 그 HNH 및 RuvC 도메인을 활성화하여 DNA 이중 가닥을 절단한다. HNH 도메인은 가이드 RNA와 상보적인 서열을 가진 표적 가닥을, RuvC 도메인은 비표적 가닥을 각각 절단하여 이중 가닥 절단을 일으킨다.

세포는 이렇게 생성된 이중 가닥 절단을 수리하기 위해 주로 두 가지 내인성 경로를 사용한다. 첫 번째는 비상동 말단 연결(NHEJ)이다. 이 경로는 절단된 말단을 신속히 재연결하지만, 삽입 또는 결실과 같은 작은 돌연변이를 빈번히 유발한다. 이는 유전자 기능을 파괴하는 '녹아웃'을 달성하는 데 효과적이다. 두 번째는 상동 지향성 수리(HDR)이다. 이 경로는 세포가 제공하는 상동성 지도 서열을 주형으로 사용하여 절단 부위를 오류 없이 정밀하게 수리한다. 연구자들은 원하는 서열을 가진 외부 DNA 주형을 함께 도입함으로써 HDR 경로를 유도하여 정확한 유전자 삽입이나 교정을 수행한다.

두 수리 경로의 선택은 세포 주기와 효율성에 영향을 받는다. NHEJ은 세포 주기 전반에 걸쳐 활성인 반면, HDR은 주로 S기와 G2기에 활발하다. 또한, Cas9 단백질이 DNA에 결합한 상태를 오래 유지하도록 변형하거나, NHEJ 경로를 억제하는 약물을 사용하는 등 HDR 효율을 높이기 위한 다양한 전략이 연구되고 있다.

CRISPR-Cas9 시스템의 기원은 박테리아와 고세균의 고유한 적응 면역 기작에 있다. 1987년 일본 연구팀이 대장균의 유전체를 분석하던 중, 특이하게 반복되는 DNA 서열을 발견했으나 당시에는 그 기능이 명확히 규명되지 않았다[3]. 이후 2000년대 초반에 이르러, 여러 미생물의 유전체 서열에서 유사한 패턴이 확인되며, 이 구조는 'CRISPR'이라는 명칭으로 통합되어 불리게 되었다.

이러한 CRISPR 배열은 박테리아가 이전에 감염된 파지나 플라스미드 같은 외부 유전 물질의 일부 조각을 자신의 유전체에 기록해 두는 '분자 주민등록부' 역할을 했다. 배열 사이사이에 끼어 있는 이 외부 유전자 조각들은 '스페이서'라고 불렸다. 연구가 진행되면서, CRISPR 배열 옆에는 항상 특정 유전자군이 위치해 있으며, 이는 'CRISPR-associated'의 약자인 Cas 유전자로 명명되었다. 2005년을 전후로 여러 연구팀은 스페이서 서열이 파지나 플라스미드의 DNA 서열과 일치한다는 사실과, CRISPR 배열이 풍부한 균주가 해당 병원체에 대한 저항성을 보인다는 것을 밝혀내며, 이 시스템이 박테리아의 획득 면역 체계임을 입증했다.

박테리아의 방어 메커니즘은 크게 세 단계로 이루어졌다. 첫째, '적응' 단계에서 새로운 병원체가 침입하면, 그 DNA의 일부가 잘려 나와 스페이서 형태로 CRISPR 배열 선두에 통합되었다. 둘째, '발현' 단계에서 이 CRISPR 배열은 전사되어 짧은 crRNA를 생성했다. 마지막으로 '간섭' 단계에서 이 crRNA는 Cas 단백질(예: Cas9)과 복합체를 형성하여, crRNA 서열과 상보적인 외래 DNA 서열을 찾아 표적을 정확하게 절단하고 무력화시켰다. 이 복잡한 생물학적 과정의 해명은 단순한 미생물학적 호기심을 넘어, 혁명적인 유전자 편집 도구의 토대를 마련하는 계기가 되었다.

제니퍼 다우드나와 에마뉘엘 샤르팡티에가 이끄는 연구팀은 2012년에 박테리아의 CRISPR-Cas9 시스템이 실험실 환경에서 프로그래밍 가능한 유전자 가위로 기능할 수 있음을 증명하는 획기적인 논문을 발표했다[4]. 그들은 박테리아의 복잡한 면역 반응을 단순화하여 두 가지 핵심 구성 요소만으로 구성된 인공 시스템을 구축했다.

이 시스템의 핵심은 합성 가이드 RNA와 Cas9 단백질이다. 연구자들은 표적 DNA 서열과 상보적인 서열을 가이드 RNA에 설계하여 주입하면, Cas9 단백질은 이 RNA의 안내를 받아 정확히 해당 위치로 이동해 DNA 이중 가닥을 절단한다. 이 절단은 세포의 자연적인 DNA 수리 경로를 활성화시키는 트리거 역할을 한다.

이 발견은 기존의 징크 핑거 뉴클레아제나 TALEN 같은 유전자 편집 기술에 비해 훨씬 더 빠르고, 저렴하며, 사용하기 쉬운 도구를 제공했다. 실질적으로 어떤 DNA 서열이든 표적으로 삼을 수 있게 되면서, 전 세계 수천 개의 연구실에서 유전자 기능 연구, 질병 모델 제작, 유전자 치료 가능성 탐구에 이 기술을 즉시 활용하기 시작했다.

CRISPR-Cas9 기술의 발전은 초기 박테리아의 적응 면역 기작 발견에서 시작하여, 현재의 강력한 유전자 편집 도구로 진화하는 과정을 거쳤다. 주요 발전 단계는 다음과 같이 요약할 수 있다.

2013년 이후로 기술 발전은 정밀도 향상과 응용 분야 확대로 이어졌다. 표적 외 효과를 줄이기 위해 변형 Cas9 단백질(예: 고정밀도 변이체)이 개발되었고, 절단 기능을 제거한 dCas9을 활용한 CRISPRi/CRISPRa 기술로 유전자 발현을 조절하는 새로운 도구가 등장했다. 더 나아가 DNA 절단 없이 염기 하나를 직접 바꾸는 Base Editing(2016년)과 더 복잡한 편집이 가능한 Prime Editing(2019년) 기술이 개발되며, 치료적 적용의 정밀성과 안전성이 한층 높아졌다. 이러한 발전은 기술을 기초 연구 도구를 넘어 유전자 치료와 정밀 농업 등 실제 응용 분야로 확장시키는 기반을 마련했다.

유전자 가위 기술은 기초 생물학 연구에 혁신적인 변화를 가져왔다. 이전에는 시간과 비용이 많이 들었던 유전자 녹아웃이나 유전자 발현 조절 실험이 비교적 간단하고 빠르게 수행될 수 있게 되었다. 연구자들은 특정 유전자의 기능을 알아내기 위해 해당 유전자를 정확하게 제거하거나 변형시킨 후, 세포나 생물체에서 나타나는 표현형 변화를 관찰할 수 있다. 이를 통해 암, 신경 퇴행성 질환, 발달 생물학 등 다양한 분야에서 핵심 유전자의 역할을 규명하는 연구가 가속화되었다.

이 기술은 모델 생물의 범위를 크게 확장시켰다. 기존에 유전자 조작이 어려웠던 많은 동식물 종에서도 CRISPR-Cas9을 이용한 유전체 편집이 가능해졌다. 예를 들어, 다양한 작물, 어류, 곤충 등에서 표적 유전자 편집 연구가 활발히 진행되고 있다. 또한, 세포주나 유도만능줄기세포를 이용한 *인 비트로* 연구 모델을 구축하는 데에도 핵심 도구로 활용된다.

연구 방법론 측면에서는 유전자 회로 분석과 고속 스크리닝에 큰 영향을 미쳤다. CRISPRi와 CRISPRa 기술을 이용하면 유전자의 발현을 억제하거나 증가시켜, 복잡한 유전자 네트워크 내에서 각 유전자의 상호작용을 체계적으로 분석할 수 있다. 더 나아가, 수천 개의 유전자에 대한 기능을 한 번에 스크리닝하는 유전체 규모의 CRISPR 스크리닝은 특정 생물학적 조건(예: 약물 내성, 바이러스 감염)에 관여하는 새로운 유전자들을 대규모로 발굴하는 데 필수적인 도구가 되었다.

유전자 가위 기술은 유전자 치료 분야에 혁신적인 가능성을 열었다. 이 기술은 단일 유전자 질환을 비롯한 다양한 질병의 근본 원인을 표적하여 교정할 수 있는 잠재력을 지닌다. 현재 연구 단계에서는 유혈색소증, 겸형 적혈구 빈혈증, 뮤코다당증, 유전성 근이영양증 등에 대한 치료법 개발이 활발히 진행 중이다[7]. 또한 암 치료 분야에서는 환자의 면역세포(T세포)를 유전적으로 변형시켜 항원을 인식하도록 하여 암세포를 공격하는 CAR-T 세포 치료의 효율을 높이는 데에도 적용되고 있다.

치료 전략은 크게 체세포 치료와 생식세포/배아 치료로 구분된다. 체세포 치료는 환자의 특정 조직 세포(예: 조혈모세포, 간세포)를 체외에서 편집한 후 다시 주입하거나, 바이러스 벡터 등을 이용해 체내에서 직접 표적 세포의 유전자를 수리하는 방식을 취한다. 이는 해당 환자에게만 효과가 국한되며 다음 세대로 유전되지 않는다. 반면, 생식세포나 초기 배아의 유전자를 편집하는 것은 유전적 변화가 자손에게까지 전달될 수 있어 훨씬 더 큰 윤리적 논란을 불러일으키고 있다.

현재까지의 임상 적용은 주로 혈액 관련 질환에 집중되어 있으며, 이는 표적 세포에 접근하고 편집된 세포를 재도입하는 기술적 용이성 때문이다. 간, 근육, 중추신경계 등의 조직을 표적으로 하는 치료법 개발은 여전히 기술적 난제에 직면해 있다. 안전성 측면에서는 표적 외 효과를 최소화하고, 원하는 유전자 교정만이 효율적으로 일어나도록 하는 전달 시스템의 정밀도를 높이는 것이 핵심 과제로 남아 있다.

CRISPR-Cas9 기술은 기존의 육종 방법보다 훨씬 빠르고 정밀하게 원하는 형질을 작물에 도입할 수 있어 농업 분야에서 혁신적인 변화를 가져오고 있다. 이 기술은 유전자 변형 작물을 개발하는 데 활용되며, 기후 변화 적응성 강화, 수확량 증대, 영양성분 개선, 병해충 저항성 부여 등 다양한 목표를 달성하기 위해 적용된다.

주요 응용 사례로는 병저항성 증대를 들 수 있다. 예를 들어, 버섯의 갈변을 유발하는 효소 유전자를 편집하여 상품성을 높인 버섯이 개발되었으며, 바나나에 치명적인 파나마병을 일으키는 곰팡이에 저항성을 갖도록 유전자를 편집하는 연구가 진행 중이다. 또한 쌀, 밀, 옥수수 등 주요 곡물에서 흰가루병, 깜부기병 등에 대한 저항성을 부여하는 연구가 활발하다.

이러한 기술은 기존 유전자 변형 생물체(GMO)와 구분되는 '유전자 편집 생물체'로 분류되기도 하며, 규제 체계가 국가마다 상이한 상황이다. 일부 국가에서는 외부 유전자가 삽입되지 않은 경우 기존 GMO 규제를 적용하지 않는 반면, 다른 국가들은 새로운 규제를 마련하고 있다. 농업 분야에서의 CRISPR 기술은 지속 가능한 농업과 식량 안보 문제 해결에 중요한 도구로 평가받고 있다.

CRISPR-Cas9 기술은 기초 연구와 임상 의학을 넘어 산업 생명공학 분야에서도 혁신적인 변화를 주도하고 있다. 이 기술은 미생물 공장을 효율적으로 설계하거나, 바이오 연료 생산을 최적화하며, 새로운 바이오 물질을 합성하는 데 핵심 도구로 활용된다. 특히 대사 공학 분야에서 유전자 회로를 정밀하게 조작하여 원하는 대사 산물의 생산량을 극대화하는 데 유용하다.

산업 미생물의 게놈을 편집하여 효소 활성을 개선하거나 불필요한 대사 경로를 차단하는 응용이 활발하다. 예를 들어, 효모나 대장균과 같은 모델 세포의 유전자를 조작하여 의약품 전구체, 바이오 플라스틱 원료, 또는 향료 등을 더 효율적으로 생산할 수 있다. 다음 표는 주요 산업 응용 사례를 보여준다.

또한 합성 생물학과의 융합을 통해 더 복잡한 생물 공학 시스템 구축이 가능해졌다. 연구자들은 CRISPRi(유전자 발현 억제)나 CRISPRa(유전자 발현 활성화) 기술을 이용해 여러 유전자의 발현 수준을 동시에 조절함으로써 세포를 프로그래밍할 수 있다. 이는 마치 생물학적 소프트웨어를 설계하는 것과 같아, 세포로 하여금 환경 신호에 반응하거나 특정 패턴으로 물질을 생산하도록 지시할 수 있다[8]. 이러한 접근법은 지속 가능한 바이오 경제로의 전환에 기여할 잠재력을 가지고 있다.

CRISPR-Cas9 기술은 기존의 유전자 편집 기술에 비해 뛰어난 정밀성, 높은 효율성, 그리고 상대적으로 쉬운 접근성을 제공한다는 점에서 혁신적이다.

정밀성 측면에서, 이 기술은 가이드 RNA의 서열을 설계함으로써 게놈 상의 특정 부위를 정확하게 표적할 수 있다. 약 20개의 염기로 구성된 가이드 RNA 서열은 상보적인 DNA 서열과 결합하여 Cas9 단백질을 정확한 위치로 안내한다. 이는 징크 핑거 뉴클레아제나 TALEN과 같은 이전 기술들이 복잡한 단백질 공학을 필요로 했던 것과 대비된다. 그러나 완벽한 정밀성을 보장하지는 않으며, 유사한 서열을 가진 부위를 잘못 절단하는 표적 외 효과가 발생할 수 있다.

효율성과 접근성은 이 기술의 보급을 가속화한 핵심 요소다. 시스템의 구성이 비교적 단순하여, 표적 부위를 변경하려면 가이드 RNA의 서열만 교체하면 된다. 이로 인해 실험 설계부터 실행까지의 시간과 비용이 크게 절감되었다. 또한, 상용화된 다양한 플라스미드 키트와 서비스 덕분에 전문적인 단백질 공학 지식이 없는 연구실에서도 비교적 쉽게 도입하고 활용할 수 있게 되었다.

이러한 장점들을 요약하면 다음과 같다.

결과적으로, CRISPR-Cas9은 생명과학 전 분야에 걸쳐 유전자 기능 연구와 유전자 치료 개발 등을 빠르게 진전시키는 기반 기술로 자리 잡았다.

표적 외 효과는 CRISPR-Cas9 시스템이 의도한 표적 DNA 서열 이외의 유사한 서열을 잘못 인식하여 절단함으로써 발생하는 비의도적 유전자 변이를 가리킨다. 이는 기술의 안전성을 저해하는 가장 주요한 기술적 한계 중 하나로 지목된다. 표적 외 절단은 가이드 RNA의 서열과 부분적으로 일치하는, 특히 1~3개의 뉴클레오타이드 불일치가 있는 유전체 상의 다른 위치에서 발생할 수 있다. 이러한 비특이적 결합과 절단은 예측하기 어려운 돌연변이를 초래하여, 연구 결과의 신뢰성을 떨어뜨리거나 치료 적용 시 암 발생 등의 심각한 부작용을 유발할 위험성을 내포한다.

표적 외 효과의 빈도와 심각성은 여러 요인에 의해 영향을 받는다. 주된 요인으로는 가이드 RNA의 설계 정밀도, 사용된 Cas9 단백질의 변이체 종류, 세포의 종류 및 상태, 그리고 표적 부위의 염색질 구조(개방 또는 밀집 상태) 등이 있다. 예를 들어, 표준적인 Streptococcus pyogenes 유래의 Cas9(SpCas9)은 상대적으로 표적 외 활성이 높은 것으로 알려져 있으며, 이를 개선한 고정밀 변이체(예: SpCas9-HF1, eSpCas9)들이 개발되었다[9].

표적 외 효과를 평가하고 최소화하기 위한 다양한 전략이 개발되고 있다. 생물정보학적 도구를 이용한 가이드 RNA 설계 시 유전체 전체를 스캔하여 유사 서열이 적은 표적을 선정하는 것이 첫 번째 단계이다. 실험적 평가 방법으로는 Digenome-seq, GUIDE-seq, CIRCLE-seq 등의 전유전체적 오프타겟 검출 기술이 활용된다[10]. 또한, 앞서 언급한 고정밀 Cas9 변이체 사용, Cas9 단백질을 뉴클레아제 활성이 없는 상태로 만든 dCas9에 절단 효소를 융합하는 이중 뉴클레아제 시스템(예: Cas9 nickase 활용), 또는 절단 기능을 완전히 제거하고 전사 조절에 사용하는 CRISPRi/CRISPRa 시스템을 적용하는 것도 표적 외 변이 위험을 회피하는 대안이 된다.

유전자 가위 기술, 특히 CRISPR-Cas9의 급속한 발전은 인간 배아 편집, 생식세포계 변형과 같은 근본적인 생명 조작을 가능하게 하면서 심각한 윤리적 문제를 제기한다. 가장 첨예한 논란은 생식세포 또는 초기 배아의 유전자를 편집하는 행위다. 이러한 변경은 개인에게만 국한되지 않고 그 자손에게까지 유전되므로, 인류 유전자 풀에 의도치 않게 개입하는 결과를 초래할 수 있다. 이는 '디자이너 베이비'와 같은 우생학적 적용에 대한 우려와 함께, 기술의 불완전성으로 인해 발생할 수 있는 예측 불가능한 유전적 부작용이 후대에 전승될 위험성을 내포한다.

안전성 측면에서 가장 큰 기술적 걸림돌은 표적 외 효과다. 이는 가이드 RNA가 의도한 표적 DNA 서열 외에 유사한 서열을 잘라내어 원치 않는 돌연변이를 일으킬 수 있는 현상을 말한다. 이러한 오류는 암을 유발하거나 세포 기능에 심각한 장애를 초래할 가능성이 있다. 또한, 표적 부위에서 DNA가 절단된 후 세포의 자연적인 DNA 수리 메커니즘인 비상동말단접합에 의존하게 되는데, 이 과정은 오류가 발생하기 쉬워 예측할 수 없는 삽입 또는 결실을 만들어낼 수 있다.

윤리적 논쟁은 사회적 형평성과 접근성 문제로도 확장된다. 고비용의 첨단 유전자 치료 기술은 경제적 격차를 건강과 생명의 격차로 고착시킬 수 있다는 비판이 존재한다. 더 나아가, 기술이 완벽해진다 하더라도 어떤 유전 형질을 '개선' 또는 '제거'해야 하는지에 대한 합의는 문화, 사회, 종교에 따라 극명하게 달라질 수 있어 보편적인 기준 마련이 어렵다. 이러한 복잡성으로 인해 많은 국가와 국제 기구들은 인간 생식세포계 편집 연구에 대해 금지 또는 엄격한 제한을 두고 있으며, 안전성과 효능이 충분히 입증된 체세포 치료 적용에 초점을 맞추고 있는 상황이다[11].

Base Editing은 유전자 가위 기술의 한 변형으로, DNA 염기서열을 직접 변환하여 돌연변이를 일으키지 않고도 정밀한 유전자 편집을 가능하게 하는 기술이다. 기존의 CRISPR-Cas9 시스템이 DNA 이중 가닥을 절단한 후 세포의 수리 기작에 의존하는 방식과 달리, 이 기술은 DNA 가닥을 절단하지 않고 한 염기를 다른 염기로 화학적으로 직접 변환한다. 이로 인해 비상동말단접합과 같은 오류가 발생하기 쉬운 수리 경로를 유도하지 않아, 표적 외 효과를 줄이고 더 깨끗한 편집 결과를 얻을 수 있다.

이 기술의 핵심은 두 가지 주요 구성 요소의 결합에 있다. 첫 번째는 변형된 Cas9 단백질(nCas9 또는 dCas9)로, DNA를 절단하지 않거나 한 가닥만 절단하는 능력을 가진다. 두 번째는 시토신 탈아미노효소 또는 아데닌 탈아미노효소와 같은 효소를 융합한 단백질이다. 이 효소들은 DNA 염기에 직접 작용하여 화학적 변환을 촉매한다. 예를 들어, 시토신 염기를 우라실로 변환하면, 이후 세포의 복제 과정에서 우라실이 티민으로 인식되어 C-G 염기쌍이 T-A 염기쌍으로 영구적으로 변경된다.

이 기술은 특히 점 돌연변이로 인한 유전 질환의 치료에 큰 잠재력을 보인다. 인간 유전병의 상당수가 특정 염기 하나의 변이로 발생하기 때문이다. 예를 들어, 겸형 적혈구 빈혈증은 헤모글로빈 유전자의 특정 A가 T로 바뀌어 발생하는데, 아데닌 베이스 에디터를 이용하면 이 변이를 정상적인 염기서열로 되돌릴 수 있다. 그러나 이 기술도 완벽하지는 않아, 표적 부위 근처의 제한된 범위 내에서만 편집이 가능하고, 원하지 않는 부수적 염기 변환을 일으킬 수 있는 등 기술적 한계가 남아 있다.

Prime Editing은 CRISPR-Cas9 시스템을 기반으로 하여, DNA 염기서열을 더욱 정밀하고 다양하게 변경할 수 있는 3세대 유전자 편집 기술이다. 2019년 데이비드 리우(David Liu) 연구팀에 의해 처음 보고되었다[14]. 이 기술은 표적 DNA를 이중 가닥 절단하지 않고도, 특정 위치의 염기를 원하는 대로 교체하거나 작은 삽입 또는 삭제를 가능하게 한다. 따라서 기존 CRISPR-Cas9 기술이 주로 유발하던 표적 외 효과와 비의도적인 DNA 손상을 크게 줄일 수 있다는 장점을 지닌다.

Prime Editing 시스템은 두 가지 핵심 요소로 구성된다. 첫 번째는 절단 활성을 약화시킨 Cas9 단백질 변이체(nCas9 또는 역전사효소가 융합된 dCas9)이다. 두 번째는 Prime Editing Guide RNA(pegRNA)라고 불리는 특수 설계된 가이드 RNA이다. pegRNA는 표적 DNA 위치를 인식하는 서열 외에, 원하는 편집 정보를 담은 '프라이머 결합 부위'(PBS)와 새로운 염기서열 템플릿을 포함한다.

작동 원리는 다음과 같다. 먼저, nCas9 단백질이 pegRNA와 복합체를 이루어 표적 DNA에 결합한다. nCas9는 DNA의 한 가닥만을 절단하여 '닉'을 생성한다. 이후 pegRNA의 프라이머 결합 부위가 절단된 표적 DNA 가닥의 3' 말단에 결합하고, 여기서 역전사효소가 pegRNA에 포함된 템플릿 서열을 따라 새로운 DNA를 합성한다. 이렇게 합성된 새로운 DNA 서열이 기존의 표적 서열을 대체하게 되고, 세포의 DNA 수리 기작을 통해 최종적으로 영구적인 편집이 완성된다.

Prime Editing은 현재까지 알려진 대부분의 유전적 변이 유형(약 89%)을 교정할 수 있는 잠재력을 지닌 것으로 평가받는다. 특히 점 돌연변이에 의한 유전병 치료나 농작물의 유용 형질 도입에 있어 높은 정밀도를 요구하는 분야에서 활발히 연구되고 있다. 그러나 기술의 효율성이 표적 부위와 편집 유형에 따라 다르고, 상대적으로 긴 pegRNA를 설계 및 전달해야 하는 어려움 등 해결해야 할 과제도 남아 있다.

CRISPRi(CRISPR interference)와 CRISPRa(CRISPR activation)는 유전자 발현을 조절하지만 DNA 서열 자체를 절단하거나 변경하지 않는, CRISPR-Cas9 기술의 파생 형태이다. 이들은 Cas9 단백질의 변형체를 사용하여 특정 유전자의 전사를 억제하거나 활성화한다. 핵심 메커니즘은 표적 DNA에 결합은 하지만 절단 기능이 없는 '사멸된' Cas9(dCas9)을 활용하는 것이다. dCas9는 가이드 RNA에 의해 특정 유전자의 프로모터 또는 조절 부위로 안내되며, 그 자체가 물리적 장벽이 되어 RNA 중합효소의 결합이나 진행을 방해하거나(CRISPRi), 전사 활성화 단백질을 표적 부위로 모집하여(CRISPRa) 발현을 조절한다.

CRISPRi는 주로 dCas9 단독 또는 억제 단백질(예: KRAB 도메인)과의 융합체를 사용한다. 이 복합체가 유전자의 프로모터나 전사 시작 부위에 결합하면, 전사 기구의 접근을 차단하여 유전자 발현을 효과적으로 침묵시킨다. 반면 CRISPRa는 dCas9를 전사 활성화 도메인(예: VP64, p65AD)과 연결하여 작동한다. 이 활성화 복합체가 유전자의 증강자나 프로모터 영역에 결합하면, RNA 중합효소와 공동 인자들을 강력하게 모집하여 유전자 발현 수준을 크게 높인다.

이 기술들은 기능 유전학 연구에 매우 유용한 도구이다. CRISPRi/CRISPRa를 이용하면 특정 유전자의 기능을 녹아웃시키지 않고도 발현 수준을 정밀하게 조절하여 그 영향을 관찰할 수 있다. 이는 필수 유전자를 연구하거나, 발현량의 미세한 변화가 중요한 표현형을 이해하는 데 특히 가치가 있다. 주요 응용 분야는 다음과 같다.

CRISPRi와 CRISPRa는 유전자 편집 없이 유전자 발현을 가역적으로 조절할 수 있어, 잠재적인 표적 외 효과 중 DNA 손상과 관련된 위험을 줄인다는 장점이 있다. 이들은 기초 연구를 넘어 전사 요법이라는 새로운 치료 접근법의 기반 기술로도 주목받고 있다.

유전자 가위 기술, 특히 CRISPR-Cas9을 이용한 인간 배아의 유전자 편집은 심각한 윤리적, 사회적, 안전성 논란을 불러일으켰다. 논란의 핵심은 이러한 편집이 미래 세대에 영구적으로 전달될 수 있는 생식세포계 변이를 초래할 수 있다는 점에 있다. 2018년 중국의 과학자 허젠쿠이가 HIV 감염에 저항성을 갖도록 편집된 쌍둥이 유전자를 공개한 사건은 전 세계적인 충격과 비난을 야기하며 논쟁을 촉발시켰다[15]. 이 사례는 기술의 잠재적 오남용 위험과 국제적 규제의 부재를 적나라하게 보여주었다.

안전성 측면에서 주요 우려는 표적 외 효과이다. 의도하지 않은 위치에서 DNA가 절단되거나 변이가 발생할 경우, 암을 유발하거나 예측하지 못한 발달 장애를 초래할 수 있다. 또한 배아 단계에서의 편집은 모든 체세포에 영향을 미치므로, 그 결과는 완전히 되돌릴 수 없다. 기술이 아직 초기 단계에 있어 장기적인 영향을 충분히 이해하지 못한 상태에서 인간 배아에 적용하는 것은 큰 위험을 수반한다.

윤리적 차원에서는 "디자이너 베이비" 창출 가능성에 대한 우려가 제기된다. 질병 치료를 넘어 지능, 외모, 신체 능력 등 비의학적 형질을 개선하는 향상 유전공학으로 기술이 사용될 경우, 사회적 불평등을 심화시키고 인간 존엄성을 훼손할 수 있다. 또한 편집된 유전자가 미래 세대에 전달되는 것은 그들의 유전자 자기결정권을 사전에 침해하는 것으로 볼 수 있다는 주장도 있다.

이러한 논란에 대응하여 과학계와 국제 사회는 규제 프레임워크 구축을 모색하고 있다. 많은 국가에서 생식세포계 유전자 편집을 임상 적용에 사용하는 것을 금지하거나 엄격히 제한하고 있다. 세계보건기구는 인간 유전체 편집을 위한 글로벌 감시 및 규제 체계 수립을 권고하는 전문가 패널을 구성하는 등 국제적 합의를 도출하기 위한 노력을 지속하고 있다.

CRISPR-Cas9 기술의 상업적 가치가 명백해지면서, 이 기술의 특허권을 둘러싸고 치열한 법적 분쟁이 발생했다. 이 분쟁의 핵심 당사자는 UC 버클리 대학의 제니퍼 다우드나 연구팀과 하버드 대학 및 MIT의 브로드 연구소 소속의 펑 장 연구팀이었다. 양측 모두 CRISPR-Cas9을 진핵세포에서 사용할 수 있는 유전자 편집 도구로 개발한 핵심 발명자로 주장했다.

분쟁의 초점은 미국 특허청의 특허 심사 절차인 간섭 심판에 맞춰졌다. 브로드 연구소는 2012년에 신속 심사 제도를 이용해 진핵세포 적용에 관한 특허를 먼저 취득했고, UC 버클리 팀은 더 이른 날짜의 우선권을 주장하며 이의를 제기했다. 법적 공방은 여러 차례에 걸쳐 진행되었으며, 주요 쟁점은 진핵세포에서의 적용 가능성이 원래의 박테리아 면역 시스템 발견에서 "명백한" 발전이었는지, 아니면 "비명백한" 독창적인 발명이었는지에 있었다.

이 분쟁은 미국을 넘어 유럽과 중국 등 다른 지역으로도 확산되었다. 유럽에서는 특허 출원 과정의 형식적 요건 문제가 부각되며 다른 양상으로 진행되기도 했다. 분쟁 결과, 브로드 연구소가 진핵세포 응용 분야의 핵심 미국 특허를 공고히 하게 되었지만, UC 버클리 팀도 기초적인 CRISPR-Cas9 구성 요소에 대한 특허를 보유하게 되어 복잡한 특허 지형이 형성되었다. 이로 인해 관련 기업들은 상업화를 위해 양측과 모두 라이선스 계약을 체결해야 하는 상황에 직면하기도 했다. 이 특허 분쟁은 획기적인 기초 과학 발견이 상업적 응용 단계로 넘어갈 때 발생할 수 있는 지식재산권 갈등의 전형적인 사례를 보여준다.

유전자 가위 기술, 특히 인간 배아에의 적용은 국제적으로 복잡한 규제 체계와 논의를 낳았다. 각국은 기술의 잠재적 이점과 윤리적·안전적 위험을 저울질하며 다양한 접근 방식을 취하고 있다. 일반적으로 치료적 목적의 체세포 유전자 편집은 임상 시험 단계에서 점진적으로 허용되는 반면, 생식세포 계열 또는 배아 편집은 대부분의 국가에서 엄격히 제한되거나 금지되고 있다.

주요 국가 및 지역의 규제 현황은 다음과 같이 요약할 수 있다.

국제적 협의 차원에서는 세계보건기구(WHO)가 2019년 인간 유전체 편집에 관한 글로벌 규제 체계 구축을 위한 전문가 패널을 구성하고, 2021년 관련 거버넌스 프레임워크를 제안했다. 이 프레임워크는 국가별 규제 강화, 국제 연구 등록소 설립, 불법·비윤리적·불안전한 연구 방지를 위한 협력 등을 권고한다. 또한, 유네스코는 국제 생명윤리 위원회(IBC)를 통해 인간 유전체가 '인류의 공동 유산'임을 재확인하며, 생식세포 계열 편집에 대한 전 세계적 동결(moratorium)을 촉구한 바 있다. 이러한 논의는 기술 발전 속도에 규제가 뒤처지지 않도록 하기 위한 국제사회의 지속적인 노력을 반영한다.

정밀도 향상 기술은 표적 외 효과를 최소화하고 편집의 정확성을 극대화하는 데 초점을 맞춘다. 기존 Cas9 단백질은 가이드 RNA와 상보적인 서열 외에도 일정 수준의 불일치를 허용하여 원하지 않는 위치에서 DNA를 절단할 수 있다. 이를 해결하기 위해 고정밀 변이체 Cas9 단백질(예: SpCas9-HF1, eSpCas9)이 개발되었다. 이 변이체들은 DNA 백본과의 비특이적 상호작용을 약화시켜 표적 서열과의 결합 안정성에 더욱 의존하도록 설계되었다.

표적 부위의 인식 범위를 확장하는 접근법도 연구된다. Cas9의 대안으로 발견된 Cas12a(Cpf1) 단백질은 더 긴 PAM 서열을 인식하거나 다른 절단 말단을 생성하는 특징을 보인다. 자연계에 존재하는 다양한 CRISPR-Cas 시스템을 발굴하고 이들의 PAM 서열 선호도를 분석하여 사용 가능한 표적 부위의 폭을 넓히는 연구가 활발하다. 또한, 합성 생물학 기법을 통해 PAM 요구 사항이 완화되거나 없는 새로운 Cas 단백질을 공학적으로 설계하는 노력도 진행 중이다.

편집 효율과 정밀도를 동시에 높이기 위한 전달 시스템과 조절 방법도 발전하고 있다. RNP 복합체 형태로 직접 세포 내에 도입하는 방식은 가이드 RNA의 지속 시간을 제한하여 오프-타겟 효과를 줄일 수 있다. 또한, 크리스퍼 유전자 가위의 활성을 시간적, 공간적으로 제어할 수 있는 광유전학적 또는 약물 유도형 시스템이 개발되어, 원하는 시점과 세포 유형에서만 편집이 일어나도록 정밀 조절이 가능해졌다.

유전자 가위 기술의 임상 적용은 현재 활발한 연구 단계에서 점차 실제 치료제로의 전환을 목표로 확대되고 있다. 초기 임상 시험은 주로 체세포를 대상으로 한 유전자 치료에 집중되었으며, 겸형 적혈구 빈혈증과 베타 지중해빈혈 같은 단일 유전자 질환 치료에서 유의미한 성과를 보였다[23]. 이러한 치료는 환자의 조혈모세포를 채취해 실험실에서 헤모글로빈 생산을 방해하는 유전자를 편집한 후, 다시 환자 체내로 주입하는 방식으로 이루어진다.

현재 진행 중이거나 계획된 임상 연구의 범위는 더욱 넓어지고 있다. 연구자들은 유전성 망막 질환, 근이영양증, 특정 유전성 대사 질환 및 일부 암 치료를 위한 접근법을 탐구하고 있다. 특히, CAR-T 세포 치료와 결합하여 암세포를 인식하고 공격하는 능력을 향상시킨 면역 세포를 만드는 연구가 진행 중이다. 또한, 체내(in vivo) 편집 기술을 개발하여 간이나 근육 등 특정 장기 내 표적 세포에 직접 유전자 가위 시스템을 전달하는 시도도 가속화되고 있다.

임상 적용 확대의 주요 과제는 치료의 안전성과 효율성을 극대화하는 것이다. 표적 외 효과를 최소화하는 고정밀 변형 시스템의 개발과, 편집된 세포를 체내로 효율적으로 전달하는 안전한 전달 시스템(예: 바이러스 벡터, 지질 나노입자)의 개선이 핵심 연구 분야이다. 이러한 기술적 진보는 치료 가능한 질병의 범위를 단일 유전자 질환에서 다유전자 질환 및 더 흔한 만성 질환으로까지 확장할 수 있는 잠재력을 가지고 있다.

유전자 가위(CRISPR-Cas9) 기술의 지속적인 발전은 기존 의학, 농업의 경계를 넘어 다양한 분야에서 새로운 응용 가능성을 열고 있다. 한 가지 주요 방향은 환경 오염 대응이다. 과학자들은 특정 오염 물질을 분해하거나 감지하는 능력을 가진 미생물이나 식물을 설계하는 연구를 진행 중이다. 예를 들어, 중금속을 흡수하는 식물이나 플라스틱을 분해하는 박테리아를 개발하여 생물 복원 기술에 활용할 수 있다.

또 다른 가능성은 유전자 구동 기술을 통한 생태계 관리이다. 이 기술은 특정 유전자가 집단 내에서 빠르게 퍼지도록 설계하여, 말라리아를 전파하는 모기와 같은 해충의 개체수를 조절하거나 침입 외래종을 통제하는 데 적용될 수 있다. 그러나 이는 생태계에 예측 불가능한 영향을 미칠 수 있어 신중한 연구와 규제가 필요하다.

기술의 융합 또한 새로운 지평을 열고 있다. 인공 지능과 결합하여 대규모 유전체 데이터를 분석하고 표적 부위를 더 정확하게 설계하거나, 합성 생물학과 결합하여 완전히 새로운 대사 경로를 가진 인공 세포를 만드는 데 활용될 수 있다. 더 나아가, DNA를 정보 저장 매체로 사용하는 '분자 기록기' 개발 연구도 진행 중이며, 이는 미래 데이터 저장 기술의 패러다임을 바꿀 잠재력을 지닌다.